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熒光定量PCR分析常見術(shù)語說明
更新時間:2019-08-22 點擊次數(shù):4021次
 
  
  實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)指的是在PCR進行的同時,對其過程進行監(jiān)測的能力(即實時)。因此,數(shù)據(jù)可在PCR擴增過程中,而非PCR結(jié)束之后,進行收集。這為基于PCR的DNA和RNA定量方法帶來了革命性的變革。在熒光定量PCR(qPCR)中,反應(yīng)以循環(huán)中檢測到目標(biāo)擴增的時間點為特征,而非在一定循環(huán)數(shù)后目標(biāo)分子累計的擴增量。目標(biāo)核酸的起始拷貝數(shù)越高,則會越快觀察到熒光的顯著增加。相反,終點法檢測(也稱“讀板檢測”)測量的是PCR循環(huán)結(jié)束時累計的PCR產(chǎn)物量。
  
  熒光定量PCR將PCR擴增和檢測合并為單一步驟。這樣就無需使用凝膠電泳進行產(chǎn)物檢測,更重要的是這一方法是真正定量的。在熒光定量PCR中,熒光染料被用來在熱循環(huán)中標(biāo)記PCR產(chǎn)物。熒光定量PCR儀器在反應(yīng)的對數(shù)期測定熒光信號的積累,獲得快速的PCR產(chǎn)物定量以及客觀的數(shù)據(jù)分析。
  
  熒光定量PCR分析常見術(shù)語:
  
  擴增子:PCR過程而產(chǎn)生的DNA短片段
  
  擴增曲線:根據(jù)熒光信號相對于循環(huán)數(shù)而制作的曲線
  
  基線:PCR起始時,熒光信號還未發(fā)生變化的幾個循環(huán)
  
  Ct(閾值循環(huán)):熒光信號超過NTC(無模板對照樣品)固定閾值時的循環(huán)數(shù)。用于對擴增質(zhì)量進行驗證。
  
  核酸目標(biāo):(也稱為“目標(biāo)模板”)——需要擴增的DNA或RNA序列
  
  惰性參比染料:一種可作為內(nèi)部對照,以用于在數(shù)據(jù)分析時對報告基團染料信號進行均一化的染料。均一化是對因濃度或體積變化而隨之引起波動進行的必要校正。所有的SDSPCR試劑盒都提供了參比熒光對照。
  
  Rn(均一化報告基團):報告基團染料釋放的熒光強度除以惰性參比染料釋放的熒光強度
  
  Rn+:一次反應(yīng)的Rn值包含所有的組分,包括模板
  
  Rn-:未反應(yīng)樣品的Rn值。Rn值可通過以下方式獲?。?/div>
  
  實時熒光定量PCR(qPCR)運行的早期循環(huán)(產(chǎn)生可被檢測的熒光信號之前的循環(huán)),或不含有任何模板的反應(yīng)。
  
  ΔRn(deltaRn):在特定PCR條件設(shè)置下所產(chǎn)生的信號量級。
  
  ΔRn可通過以下公式計算:(Rn+)–(Rn-)標(biāo)準(zhǔn)品具有已知濃度的A樣本,用于繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過使用不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品,您可構(gòu)建用于未知樣品定量分析的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
  
  閾值:早期PCR循環(huán)時Rn值的平均標(biāo)準(zhǔn)差,乘以相應(yīng)的校正系數(shù)閾值應(yīng)當(dāng)設(shè)定在PCR指數(shù)擴增時的相關(guān)區(qū)域。
  
  未知:具有未知模板量的樣品。即,您需要進行檢測的樣品。
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