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Western Blot的操作程序,你知道嗎?
更新時間:2019-10-18 點擊次數(shù):1296次
 
  
  蛋白質(zhì)印跡法是由瑞士*弗雷德里希生物研究所(FriedrichMiescherInstitute)的HarryTowbin在1979年提出的。在尼爾·伯奈特(NealBurnette)于1981年所著的《分析生物化學》(AnalyticalBiochemistry)中被稱為Western Blot。
  
  蛋白免疫印跡即Western Blot,是將印跡技術與抗原-抗體反應的特異性相結(jié)合的檢測技術,用于分離和檢測生物標本中的某一特定蛋白。其基本原理實混合蛋白質(zhì)樣本通過凝膠電泳分離后,通過特殊虹吸或電場裝置印跡至固相介質(zhì)(NC膜或PVDF膜)上,將針對待測蛋白的特異性抗體作用于濾膜上,利用抗體上偶聯(lián)的酶降解底物在濾膜上生成有色沉淀物或化學發(fā)光產(chǎn)物,從而顯示出待測蛋白的存在及量。
  
  在Western Blot中使用內(nèi)參其實就是在WB過程中另外用內(nèi)參對應的抗體檢測內(nèi)參,這樣在檢測目的產(chǎn)物的同時可以檢測內(nèi)參的表達,由于內(nèi)參在各組織和細胞中的表達相對恒定,借助檢測每個樣品內(nèi)參的量就可以用于校正蛋白質(zhì)定量、上樣過程中存在的實驗誤差,保證實驗結(jié)果的準確性。此外使用內(nèi)參可以作為空白對照,檢測蛋白轉(zhuǎn)膜情況是否*、整個Western Blot顯色或者發(fā)光體系是否正常。
  
  操作程序:
  
  1.總蛋白制備;
  
  2.比色法測定蛋白含量;
  
  3.變性聚丙烯酰胺不連續(xù)凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠電泳,分離蛋白質(zhì);
  
  4.蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印電泳印跡法;
  
  5.固相免疫檢測:封閉、一抗雜交、二抗雜交;
  
  6.化學發(fā)光法檢測:顯色、曝光、顯影定影;
  
  7.結(jié)果數(shù)據(jù)分析:膠片掃描,軟件分析;
  
  8.提供實驗報告,包括詳細的實驗方法及免疫印跡實驗結(jié)果的相關圖表。
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