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操作需謹(jǐn)慎 熒光定量PCR操作注意事項分享
更新時間:2019-11-23 點(diǎn)擊次數(shù):1842次
 
  
  熒光定量PCR技術(shù)是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán),通過熒光信號不斷累積而實(shí)現(xiàn)實(shí)時監(jiān)測PCR全程,然后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。
  
  將熒光基團(tuán)加入到PCR反應(yīng)體系中,通過不斷累積熒光信號從而使對PCR全程的實(shí)時監(jiān)測實(shí)現(xiàn),再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線定量分析未知模板的方法,即是熒光定量PCR技術(shù)。在實(shí)時熒光定量PCR中,實(shí)時檢測全程PCR擴(kuò)增過程,按照反應(yīng)時間和熒光信號的變化能夠?qū)⒁粭l曲線繪制成。
  
  熒光定量PCR注意事項:
  
  1.操作規(guī)范
  
  需要規(guī)范樣品核酸提取和實(shí)時熒光擴(kuò)增時的操作,避免樣品交叉污染,酶被降解,出現(xiàn)假陽性的情況。
  
  (1)根據(jù)試驗(yàn)的分區(qū)嚴(yán)格操作,按照提取區(qū)、擴(kuò)增區(qū)、檢測區(qū)單方向流動,不能夠逆向流動物品、樣品和試劑。
  
 ?。?)在對多份樣品進(jìn)行操作的時候,制備反應(yīng)混合液,首先混合好熒光PCR反應(yīng)液、熒光探針和酶。之后在每個PCR管中進(jìn)行分裝,如此不僅會使操作次數(shù)減少,而且能夠使污染避免,還能夠使反應(yīng)的度增加。
  
  (3)在對樣品和蛋白酶k添加的過程中,要對避免酶的降解和樣品的交叉污染尤其留心。
  
 ?。?)在操作的時候,需要將陰性及陽性對照設(shè)立,能夠?qū)晒釶CR反應(yīng)的準(zhǔn)確性和可信性進(jìn)行驗(yàn)證。
  
 ?。?)使用的離心管、槍頭和PCR管需要確保沒有污染,或者將它們進(jìn)行高壓滅菌。
  
 ?。?)在完成核酸的提取之后應(yīng)當(dāng)立刻進(jìn)行儀器的擴(kuò)增,不能夠在室溫環(huán)境下過長時間放置提取的核酸,空氣中的酶能夠輕易的將其降解,其可以在-70℃冰箱內(nèi)長期保存,在-20℃冰箱內(nèi)短期保存。
  
 ?。?)因?yàn)楫a(chǎn)物氣溶膠或標(biāo)本DNA會很容易對移液器造成污染,所以需要使用可高壓處理的移液器。
  
  2.溫度設(shè)置
  
  在對熒光PCR程序進(jìn)行設(shè)置的時候,應(yīng)當(dāng)需對程序中的目標(biāo)溫度、恒溫時間和循環(huán)次數(shù)等參數(shù)仔細(xì)的核對,PCR檢測結(jié)果會受到不正確的參數(shù)設(shè)置的影響。延伸過程中,需要對熒光信號的讀取收集進(jìn)行設(shè)置。如果不對收集熒光進(jìn)行設(shè)置,那么試驗(yàn)數(shù)據(jù)將無法保存,檢測結(jié)果將沒有辦法判定,從而導(dǎo)致試驗(yàn)失敗。
  
  3.儀器擺放
  
  放置實(shí)時熒光定量PCR儀的臺面應(yīng)當(dāng)平穩(wěn),離水池較遠(yuǎn),少灰,干燥,不能有強(qiáng)光直射,室內(nèi)應(yīng)當(dāng)沒有腐蝕性氣體合良好的通風(fēng)。
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