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熒光定量PCR技術(shù)中引入的幾個重要概念
更新時間:2020-03-23 點擊次數(shù):1668次
 
  
  熒光定量PCR是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán),利用熒光信號累積實時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程,zui后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對初始模板進(jìn)行定量分析的方法。它的出現(xiàn)解決了傳統(tǒng)PCR不能對初始模板定量分析的問題。具有準(zhǔn)確性高、靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點,目前已廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)研究和醫(yī)學(xué)研究等領(lǐng)域。
  
  熒光定量PCR結(jié)果分析:
  
  一般而言,熒光擴(kuò)增曲線可以分成三個階段:熒光背景信號階段、熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段和平臺期。在熒光背景信號階段,擴(kuò)增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋,無法判斷產(chǎn)物量的變化;在平臺期,擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級增加,PCR終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系,無法計算起始模板拷貝數(shù)。因此只有在熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段,PCR產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系,故選擇在這個階段進(jìn)行定量分析。為了定量方便,在熒光定量PCR技術(shù)中引入了幾個重要的概念:擴(kuò)增曲線、熒光閾值、CT值。
  
  注:
  
  橫坐標(biāo):代表擴(kuò)增循環(huán)數(shù);
  
  縱坐標(biāo):代表熒光強(qiáng)度,每個循環(huán)進(jìn)行一次熒光信號收集。
  
  (2)熒光閾值(Threshold)
  
  在熒光擴(kuò)增曲線上人為設(shè)定的一個值,它可以設(shè)定在熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段任意位置上,但一般熒光閾值的設(shè)置是PCR反應(yīng)前3-15個循環(huán)熒光信號標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。
  
  (3)CT值
  
  每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系,起始拷貝數(shù)越多,Ct值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線,其中橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對數(shù),縱坐標(biāo)代表Ct值。因此,只要獲得未知樣品的Ct值,即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。同時,對于熒光PCR實驗來說,CT值也是判讀樣品陰陽性的重要指標(biāo)。
  
  
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