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技術(shù)服務(wù)Article

RIP實(shí)驗(yàn)流程介紹
更新時(shí)間:2022-03-29 點(diǎn)擊次數(shù):1366次
  RIP技術(shù)主要是運(yùn)用針對(duì)目標(biāo)蛋白的抗體把相應(yīng)的RNA-蛋白復(fù)合物沉淀下來(lái),經(jīng)過(guò)分離純化就可以對(duì)結(jié)合在復(fù)合物上的RNA進(jìn)行q-PCR驗(yàn)證或者測(cè)序分析。RIP是研究細(xì)胞內(nèi)RNA與蛋白結(jié)合情況的技術(shù),是了解轉(zhuǎn)錄后調(diào)控網(wǎng)絡(luò)動(dòng)態(tài)過(guò)程的有力工具,可以幫助我們發(fā)現(xiàn)miRNA的調(diào)節(jié)靶點(diǎn)。根據(jù)需求,金開(kāi)瑞可以提供RNA/蛋白、RNA/RNA互作驗(yàn)證RIP技術(shù)服務(wù)。
 
  應(yīng)用:
 
  1.用抗體或表位標(biāo)記物捕獲細(xì)胞核內(nèi)或細(xì)胞質(zhì)中內(nèi)源性的RNA結(jié)合蛋白;
 
  2.防止非特異性的RNA的結(jié)合;
 
  3.免疫沉淀把RNA結(jié)合蛋白及其結(jié)合的RNA一起分離出來(lái);
 
  4.結(jié)合的RNA序列通過(guò)定量RT-PCR或高通量測(cè)序(RIP-Seq)方法來(lái)鑒定。
 
  RIP實(shí)驗(yàn)流程:
 
  (一)細(xì)胞裂解液獲取
 
  A.單層細(xì)胞或者貼壁細(xì)胞處理
 
  1.冷PBS清洗培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞兩次
 
  2.加入冷PBS后用細(xì)胞刮將細(xì)胞刮下來(lái),收集至enpendoff管
 
  3.1500rpm,4℃離心5min,棄上清,收集細(xì)胞
 
  4.用與細(xì)胞等體積的RIP裂解液重懸細(xì)胞,吹打均勻后于冰上靜置5min
 
  5.每管分裝200ul細(xì)胞裂解液,貯存于-80℃
 
  B.懸浮細(xì)胞處理:先收集細(xì)胞再計(jì)數(shù),然后清洗裂解
 
  C.組織樣品處理
 
  1.冷PBS清洗新鮮切下的組織三次
 
  2.加入冷PBS后,用勻漿器或其他細(xì)胞分離設(shè)備使組織分散為單個(gè)細(xì)胞,計(jì)數(shù)
 
  3.1500rpm,4℃離心5min,棄上清,收集細(xì)胞
 
  4.用與細(xì)胞等體積的RIP裂解液重懸細(xì)胞,吹打均勻后置于冰上靜置5min
 
  5.每管分裝200ul細(xì)胞裂解液,貯存于-80℃
 
  (二)磁珠的準(zhǔn)備
 
  A.實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備
 
  1、enpendoff管
 
  2、磁力架
 
  3、冰盒,RIPWashBuffer置于冰上
 
  4、抗體,置于冰上
 
  5、渦旋震蕩器
 
  6、槍、槍頭放于超凈臺(tái)照射30min,槍噴DEPC水
 
  B.磁珠準(zhǔn)備過(guò)程
 
  1.重懸磁珠
 
  2.標(biāo)記實(shí)驗(yàn)所需的enpendoff管,樣品包括目的樣品,陰性對(duì)照與陽(yáng)性對(duì)照
 
  3.吸取50ul重懸后的磁珠懸液于每個(gè)enpendoff管
 
  4.每管加入500ulRIPWashBuffer,渦旋震蕩
 
  5.將enpendoff管置于磁力架上,并左右轉(zhuǎn)動(dòng)15°使磁珠吸附成一條直線,去上清,重復(fù)一次
 
  6.用100ul的RIPWashBuffer重懸磁珠,加入約5ug相應(yīng)抗體于每個(gè)樣品中
 
  7.室溫孵育30min
 
  8.將enpendoff管置于磁力架上,棄上清
 
  9.加入500ulRIPWashBuffer,渦旋震蕩后棄上清,重復(fù)一次
 
  10.加入500ulRIPWashBuffer,渦旋震蕩后置于冰上
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