免疫熒光是指只標記一種蛋白質(zhì)分子，方法比較簡單，只要按照染色步驟去做，通常不存在太多的問題。但要注意固定液的選擇，固定液選擇的合適與否，可能會直接影響染色結(jié)果。
1、冰凍切片制備：建議用新鮮組織，否則組織細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)破壞，易使抗原彌散。選用干凈鋒利的刀片、組織一定要冷凍適度等，防止裂片和脫片嚴重。
2、組織切片固定：切好片風干后立即用冰丙酮等固定液進行固定5-10 min，尤其要較長時間保存的白片，一定要及時固定和適當保存。
3、血清封閉：為防止內(nèi)源性非特異性蛋白抗原的結(jié)合，需要在一抗孵育前先用血清(與二抗來源一致)封閉，減弱背景著色。血清封閉的時間是可以調(diào)整的，一般10-30 min。
4、一抗孵育條件：在免疫組化反應中重要，包括孵育時間和抗體濃度。一抗孵育溫度有幾種：4℃、室溫、37℃，其中4℃效果較佳；孵育時間：這與溫度、抗體濃度有關(guān)，一般37℃1-2 h，而4℃過宿和從冰箱拿出后37℃復溫45 min。具體條件還要摸索。
5、二抗孵育條件：二抗一般室溫或37℃立即觀察，若將標本放在聚乙/烯塑料袋中4℃30 min-1h，具體時間需要摸索，而濃度一般有工作液，若是濃縮液還要摸索濃度，切記要避光反應。但在免疫熒光中我們一般先把二抗?jié)舛群头跤龝r間先定下，然后去摸索一抗?jié)舛群头跤龝r間。最后，熒光素標記的二抗隨著保存時間的延長，可能后有大量的游離熒光素殘留，需要注意配制時小包裝和并進行適當?shù)碾x心。
6、復染：目的是形成細胞輪廓，從而更好地對目標蛋白進行定位。一般常用DAPI復染。
7、封片：為了長期保存，我們一般用緩沖甘油等封片，此外還有專門的抗熒光萃滅封片液。避免產(chǎn)生氣泡，方法是直接在載玻片組織上滴一滴封片液，然后一手拿住蓋片某一拐角，而另一手拿對面的那個拐角，接近封片液近端的拐角先降低，直至接觸到液體時為止；當發(fā)現(xiàn)液體接觸面在不斷彌散時，則可以緩慢降低另一拐角，這樣一般不會產(chǎn)生氣泡。
